分子生物学笔记完全版(2) 笔记, 分子生物学

-cAMP 依赖性蛋白激酶.
PKA 由两个催化亚基C 和两个调节亚基R 所构成
PKA 参与cAMP 介导的转录水平调控。
PKA 的其它(下游)底物：①多种代谢相关酶②核内组蛋白和非组蛋白③膜蛋白等。
2、蛋白激酶C(PKC)
-Ca2+激活的／磷脂依赖性蛋白激酶．
调节：可被Ca2+，DAG 和磷脂酰丝氨酸激活．TPA(佛波酯)也可激活．
PKC 分子由N-端的调节区和C—端催化区（亲水的蛋白激酶结构域）所组成。
PKC 有多种亚型(>12 种)．
PKC 可激活：
①受体，如EGFR，胰岛素受体，细胞因子受体等。
②细胞骨架蛋白如Map，Tau．
②膜蛋白，如Na+-H+交换蛋白，Ca2+-ATP 酶等．
④核蛋白／转录因子，起始因子等，
⑤信号转导物如鸟苷酸环化酶，Raf-1 等．
3、Ca2+•钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Cam-PK)
Cam-PKII 是一种多功能的蛋白激酶．
4。cGMP 依赖的蛋白激酶(PKG)
功能：调节胞内钙离子．
5，DNA 依赖的蛋白激酶(DNA-PK)
调节：结合游离DNA 片段后被激活，
底物：核内DNA 结合蛋白和转录因子，如SPl，Fos／Jun，Myc 和P53，
作用：①参与DNA 修复和重组,
②通过激活TF 调节基因表达;
③参与细胞周期的关卡机制(Checkpoint).
6．丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase， MAPK)
调节：MAPK 激酶-MAPKK（MEK）。
下游底物：核内转录因子如Myc，Jun，Ets 及其它胞内蛋白．
(二)酪氨酸蛋白激酶（Tyrosine protein kinase，TPK)
—特异地催化蛋白质的酪氨酸残基磷酸化，
蛋白质酪氨酸磷酸化在细胞生长，分化和转化的调节中起重要作用。
1、经典的src 激酶家族
原癌基因c-src 蛋白产物Src 是一种酪氨酸蛋白激酶，它有三个基本结构域：从C-端至N--
端依次为SH1、SH2，SH3(SH=src
homolog)。
SHl 结构域：具酪氨酸激酶活性，
SH2 结构域：能识别并结合含磷酸化酪氨酸的短序列，
SH 结构域：通过脯氨酸和疏水性氨基酸残基与靶蛋白结合，
Src 家族：包括原癌基因src，yes，lyn，fyn，lck，blk，fgr，bcd 和yrk 编码蛋白，它们都
有TPK 活性．共同参与细胞转化的信号转导过程．
SH2 结构域在信号转导途径中的重要作用：由于含SH2 结构域的信号转导分子可以识别和
结合其他含磷酸化酪氨酸的蛋白，因此，通过蛋白质的酪氨酸磷酸化／去磷酸化调节可以决
定信号转导分子的结合与解离，从而导致信号的开启或关闭。
2、JAK 嫩酶家族
JAK(Janus kinase)激酶家族包括Jakl，Jak2，Jak3，Tyk2 等，
Jak 激酶具有一个TPK 结构域和一个激酶样结构域，它们与Src 的TPk 激酶结构域具有同源
性，但JaK 激酶没有SH2，SH3 结构域；
Jak 激酶主要参与细胞因子的信号转导．
二、蛋白磷酸酯酶对磷酸化的调节
(一)、丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酯酶
这类酶选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链，使之脱去磷酸基团并改变生
物活性．
主要成员：PPl，PP2A，PP2B，PP2C，等．
PP2A，催化亚基及其功能．
(二)酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase)
蛋白质酪氨酸磷酸酯酶催化磷酸化酪氨酸残基的去磷酸化反应，与相应的酪氨酸蛋白激酶共
同调节蛋白质的磷酸化水平，
PTPase 家族可分为2 类：
1、胞质型(非受体型)：小的可溶性蛋白，只有一个催化结构域，
特点是合有SH2 domain，如PTPlC，，PTPlB 等． ，
2．受体型(PTPR)，是大的跨膜蛋白，特点是有2 个串联的胞浆催化结构域，如白细胞共同
抗原CD45，
PTPlC(存在于造血细胞)：N 端2 个串联重复的SH2 结构域{识别Tyr•P，并指导蛋白
与蛋白结合)，C 端为磷酸酯酶催化结构域。
Jak 可作为PTP1C 底物．
PTPase 基因可能是肿瘤抑制基因．
第三节 细胞膜受体介导的信号转导
一、受体的分类
质膜受体和胞内受体（胞浆或核受体，如类固醇激素受体）
膜受体的分类：
（一）G 蛋白耦联受体家族
又称为七次胯膜受体家族，特点是具有七段跨膜的α螺旋结构，本身无酶活性，胞浆侧肽链
上有磷酸化位点，受体功能受磷酸化调节。成员；肾上腺素受体、多巴受体、视紫红蛋白等。
（二）酪氨酸激酶受体家族
受体本身胞浆侧有蛋白酪氨酸激酶活性，并且胞浆侧肽链上有自身磷酸化位点，配基结合后
受体形成二聚体，二聚体中每个亚基可以磷酸化对应的另一亚基，从而启动信号转导。
这类受体主要包括多数生长因子受体(如IGF，EGF，PDGF，NGF，SCF，HGF 等生长因子
的受体)，除胰岛素受体外，这类受体均由一条肽链组成．
(三)细胞因子受体家族
这类受体本身无TPK 活性，但其胞浆侧近膜部分有非受体酪氨酸蛋白激酶的结合位点，在
配基与受体结合后，受体发生二聚化或寡聚化，并激活Jak 族蛋白酪氨酸激酶．
此类受体包括细胞因子受体以及生长激素、促乳素等受体．
细胞因子(cytokine)：是淋巴细胞和造血细胞产生的一大类对细胞生长和分化有调节作用的
蛋白因子。包括干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、白血病抑制因子（LIF）、抑癌素M 等
(但IL-8R 为G 蛋白藕联受体)
(四)离子通道受体
与配基结合后构成离子通道，主要存在于神经突触，如乙酰胆碱(ACH)，5-HT 受体等。
二、G 蛋白介导的信号转导 。
G 蛋白藕联受体的信号转导途径由三部分组成：
①细胞膜受体；②G 蛋白③效应物(effector)，其中G 蛋白将受体与效应物藕联．
G-蛋白(G-protein)是一种鸟苷酸结合蛋白，是由α、β和γ三个亚基组成的异三聚体，
多，β和γ亚基总是紧密结合在一起作为一个功能单位Gβγ
Gα亚基可分为Gs,Go,Gi,Gq 等，其活性可被霍乱毒素（CT）或百日咳毒素（PT）修饰。
G-蛋白介导的信号转导的机制：G-蛋白循环。
G-pr 的效应物：离子通道、腺苷酸环化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2 等
三、RAS-MAPK 信号转导途径
1、途径中的信号分子
Ras：具鸟苷酸结合活性的一种胞浆蛋白（与G-蛋白不同)
Ras 活性与其结合的鸟苷酸有关。
鸟苷酸交换因子（SOS）
Ras•GDP Ras•GTP
(失活) GTP 酶激活蛋白（GAP） （激活）
接头蛋白：生长因子受体结合蛋白Grb2，通过其SH2 结构域与Tyr 被磷酸化的受体结合，
同时通过其SH3 域与具有pro 富集区的SOS 结合，并通过SOS 活化Ras 蛋白．
2、Ras-MAPK 途径：
生长因子→生长因子受体(具酪氨酸激酶活性)→含有SH2结构域的接头蛋白(如Grb2)→鸟苷
酸交换因子SOS→Ras-GTP→Rafl→MAPKK（MEK）→MAPK→转录因子→调节基因表达。
3．Ras-MAPK 途径的调节
①Ras-MAPK 途径中信号转导分子的突变(如Ras)和表达量的改变．
②其他信号转导途径的影响
cAMP-PKA：抑制Raf-1； PKC：活化Raf~l，
四、Jak-stat 途径：
STAT：信号转导物与转录激活剂（signal transducer and activators of
transcription）
至少6 种，分子量84-113KD，含一个SH2 结构域(羧端)，一个SH3 样结构域，并合有DNA
结合域，Stat 的激活依赖通过磷酸化形成二聚体．
Jak-Stat 途径：
细胞因子→ 受体( 二聚体化) → Jak → Stat → Stat 二聚体( 活化) → 易位至核， 影响转
录． •
第六章 细胞周期及其调节
细胞增殖(cell proliferation)与细胞生长分裂周期．
第一节 细胞周期
一、细胞周期(cell cycle)：指亲代细胞分裂结束到子代细胞分裂结束所经历的过程，这个过
程所需的时间称为细胞周期时间。
细胞周期由G1、S、G2 和M 期组成(G1、S 和G2 期又合称为分裂间期)。
G1(Gap1)期：DNA 合成前期(复制前期)，从上次有丝分裂完成到DNA 复制之前的阶段;
S 期：DNA 复制期;
G2 期：合成后期，从DNA 复制完成至有丝分裂开始;
M 期：有丝分裂(Mitosis)期，包括核分裂和胞质分裂．
M 期结束后形成两个新的子细胞。
注：①不同细胞的细胞周期时间不同，一般S+G2+M 期较恒定，而G1 期变化较大，因而它
决定了细胞周期时间的长短；
②G1 期细胞有三种可能的趋向：1)进入S 期(即进入细胞周期)．2)处于静止期即Co 期(在一
定条件下可重新进入增殖周期)，3)分化、衰老、凋亡。
二、细胞周期中各时相的主要生化事件
细胞周期中每期都有其特殊功能，其中S 期的DNA 复制和M 期细胞核的有丝分裂是细胞
周期中2 个最关键的过程：
1、G1 期：为DNA 复制作准备，G1 早期合成各种RNA、结构蛋白和酶等，细胞通过一个
限制点(restriction
point，R 点)后在G1 后期合成DNA 复制有关的蛋白和酶。
在开始合成DNA 之前有一个关卡(checkpoint)，检查染色体DNA 是否有损伤，如有则先要
进行修复。
2、S 期：DNA(包栝端粒)的复制及组蛋白合成、核小体装配．S 期后每一染色体复制成2
个染色单体•
S→G2 期关卡：检查DNA 复制是否完成
3、G2 期：为有丝分裂作准备．有RNA 和非组蛋白合成。
4、M 期：染色体浓缩一仿锤体形成→染色体分离并移向细胞两端→染色体解聚，形成两个
新核→胞质分裂。
第二节 周期素依赖性蛋白激晦与细胞周期调节
周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)
通过使特异底物磷酸化调节细胞周期进行，其活性依赖与周期素(cyclin)结合形成复合物。
一、周期素-周期素依赖性蛋白激酶
周期素家族和周期素依赖蛋白激酶(CDK)家族．
细胞周期的不同时相表达不同cyc-CDK，这些cyc-CDK 复合物在各不同的细胞周期过渡点
起作用．
1、G1 期cyc-CDK
G1 期表达的周期素为周期素C、D（D1、D2、D3)和E。
D 族周期素主要与CDK4(以及CDK2、CDK5、CDK6)结合成活性的蛋白激酶复合物，对细
胞通过R 点(G0→G1 过渡有重要作用。
E 族周期素与CDK2 形成复合物。
cycE-CDK2 复合物调控G1→S 过渡。
2、S 期和M 朔cyc-CDKs
cycA-CDK2：驱动细胞通过S 期．
cycB-cdc2：驱动G2→M 期过渡(cdc2 或p34cdc2 即CDKl)．
二、周期素依赖性蛋白激酶抑制物
(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKIs)
CKls 通过与CDKs 结合而抑制激酶活性，在细胞周期中起负调控作用．
CKIs 一般按其分子量命名． ：
CKls 的分类：
1、Kip／Cip 家族：包括三种结构相关蛋白P21、P27、P57、特点是能结合并抑制大多数
cyc-CDK 复合物；
P21(其它名称WAFI／CIPl 等)：可被P53 诱导转录，P21 抑制cycDl-CDK4 和cycE-CDK2，
参与(由于DNA 损伤诱导的)P53 介导的细胞周期停止。
P27 参与血清去除、接触抑制和TGF-β等导致的细胞周期停止。
2、 INK4 蛋白家族，包括四种相关蛋P16、P15、P18、P19．
特点：INK4 是cycD-CDK4 和cycD-CDK6 的专一性抑制剂，并与CDK 单体结合。
P15 可能参与TGF-β诱导的细胞周期停止于G1 期， ’
三、细胞周期调节因子与肿瘤
1、cyclin 和CDKs 可能为原癌基因，其突变或过度表达可导致细胞转化。
2、CKI 可能是广谱的肿瘤抑制基因，其失活导致CDK 活性失调。
p16(MTSl)在肿瘤中突变特点及其作用。
第三节 细胞周期的其它调节机制
生长因子、生长抑制因子、原癌基因(如，myc)和抑癌基因产物、蛋白质可逆磷酸化、蛋白
水解等对细胞周期也有重要调节作用。
一、pRB ， •
抑癌蛋白，分子量106KD，其活性与磷峻化状态有关：
G0 及G1 早期：pRB 非磷酸化，与转录因子E2F-1 结合(抑制转录)
GF 等→cycD-CDK4 及cycE-CDK2 激活→pRb 磷酸化(失活)→释放E2F→DNA 合成基因表
达。
二、p53
抑癌蛋白(转录因子)，
在细胞周期中的作用：参与细胞周期关卡-DNA 损伤检查的关键蛋白(通过诱导P21 转录使
细胞周期停止于G1 期)。
三、细胞因子对细胞周期的作用．
1．生长因子在细胞通郧点中的作用
GF→GFR→Ras-MAPK→fos/jun 等基因表达→cycD-CDK4 等表达→pRB 磷酸化→E2F 释放
→进入细胞增殖周期。
2、生长抑制因子与细胞周期停止
TGF-β使细胞周期停止于G1 期。
四、泛有素(Ubiquitin，Ub)介导的蛋白水解作用
周期素，周期素依赖性蛋白激酶抑制剂(如P27)以及其它细胞周期调节蛋白均可通过泛有素
介导的蛋白酶水解作用降解，这些按精确的时间顺序进行的蛋白水解反应在细胞周期的不同
阶段起着重要的调节作用。
第七章 细胞凋亡
凋亡（apoptosis）, 程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）
生理性细胞死亡。
第一节 细胞凋亡概论
一、凋亡与坏死apoptosis vs. necrosis）
凋亡是一个受细胞主动调节的自身消化过程，凋亡细胞的特征形态学改变使其可被其它细胞
吞噬而不泄露胞质内容物，不会引起炎症反应。
坏死是由于物理损伤、缺血或细菌毒素等引起的破坏性细胞死亡过程，细胞内容物的释放导
致局部炎症反应。
二、凋亡的生理功能
1、 维持组织稳态平衡（homeostasis）,通过干细胞分裂产生新细胞的同时，选择性地除去
那些损伤的或老的或多余的细胞。
2、 清除不需要的免疫细胞。
3、 神经元发育
4、 个体发育
三、凋亡细胞的形态学和生化特征
1、 细胞皱缩（shrinkage）
2、 质膜出泡（blebbing）
3、 染色质浓缩
4、 DNA 裂解：核小体DNA ladder
5、 磷脂酰丝氨酸由质膜内侧翻转至外侧
6、 凋亡小体的释放
第二节 凋亡的分子机制
一、细胞表面死亡受体
细胞死亡受体家族的成员是一类跨膜蛋白，它们均含有一个与配基结合的胞外结构域；一个
跨膜域和一个转导胞外信号进入胞内的胞内结构域(死亡结构域)。这此受体（如Fas、TNF
受体）同它们的配基结合后被激活并导致细胞凋亡。
二、Bcl-2 家族
对B 细胞淋巴瘤的研究发现bcl-2 是一种抗凋亡基因，进一步研究证明它与ced-9 基因同源。
1、 由于8：14 染色体易位所致的bcl-2 过度表达抑制肿瘤细胞凋亡。
2、 与Bcl-2 功能相似的有Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, and A1 等，构成一个大的蛋白家族。
3、 这些蛋白表达于线粒体、内质网和核被膜的外膜，Bcl-2 及其高度同源物Bcl-xl 保护线
粒体膜的完整性。
Bax-促进凋亡的Bcl-2 家族成员：
1、 与Bcl-2 结合的蛋白，包括Bax、Bak、Bik 、Bid、 Bim 和HRK。
2、 当在细胞中过度表达时促进凋亡，其杀细胞活性可被Bcl-2 类蛋白拮抗。
3、 抗凋亡蛋白和促进凋亡的蛋白如Bcl-2 和Bax 间的比率决定细胞对凋亡信号的敏感性。
4、 Bax 可被 P53 上调，这是DNA 损伤时P53 诱导细胞死亡的一种方式。
5、 这些蛋白通常存在于其它胞内隔室如胞浆中，在凋亡时移动进入线粒体。
三、Caspase 蛋白酶-实施凋亡的蛋白酶
1、 这是一族半胱氨酸（cysteine）催化的在天冬氨酸（aspartic acid）处裂解底物的蛋白酶
（半胱天冬酶）
2、所有Caspase 先以无活性的酶原（procaspase）的形式合成，其激活过程包括：①二聚体
化②caspase 自身序列裂解成小亚其和大亚基③除去prodomain。
3、最早发现的 caspase 为IL-1β转化酶 (ICE=caspase-1) 它将 pro-IL-1 前体裂解成其活
性形式。
ICE 基因转染导致细胞凋亡。此过程可被一种牛痘病毒蛋白CrmA 抑制。 CrmA 抑制所有
caspase。
4、已知该家族成员超过12 个，虽然其中某些 caspase 参与白细胞介素的成熟，但大多数作
用是激活凋亡
。通过在特异性caspase 裂解位点(e.g. DEV D)处裂解靶蛋白，而使蛋白激活或失活，从而影
响凋亡。
例如：
a. DFF -DNA fragmentation factor- cleavage of an inhibitory
subunit activates this nuclease which cuts the DNA into a distinct
ladder-likepattern and for chromatin to condense.
b. PARP -Poly-ADP ribose polymerase, a DNA repair enzyme
inactivated by caspases
c. nuclear lamin - causes nucleus to lose its structural integrity
after cleavage
d. cytoskeletal proteins - cleavage causes membrane blebbing
5、杀伤 T-淋巴细胞可释放颗粒酶（granzymes）于靶细胞上而诱导凋亡： granzymes 裂解
和激活
caspase→诱导凋亡
6、现正研究能完全阻断凋亡的caspases 抑制剂， 看它们是否能保护中风、心梗和器官移植
中细胞免于因缺血诱导的凋亡
四、 Caspases 的激活
（一）死亡受体被其配基激活
1、TNF 受体与称为TRADD 的蛋白结合，后者再结合 FADD； Fas 直接与 FADD 结合。
2、 FADD 结合caspase-8 (又称为 FLICE),它含有死亡结构域同时又具蛋白酶催化活性
3、 活化的caspase-8 激活凋亡途径.；
4、 .触发激活的关键是受体的寡聚化。在 Fas 系统中 FasL 与 Fas 的相互作用导致 Fas 受
体形成三聚体,从而激活凋亡。
5、FasL 也是一个单一跨膜蛋白。FasL 既可通过与之相互作用杀死相邻细胞，也可激活细
胞自身的Fas 而自杀。
（二）Apaf1- caspase 活化蛋白
1、Caspase-8 裂解 Bid 使其 C-端域易位至线粒体中。
2、Bid 及其它 Bcl2 家族促凋亡蛋白的作用导致线粒体释放细胞色素C。.
3、Bcl2 抑制cytochrome c 释放。
4、Cytochrome c 在胞浆中与Apaf-1 结合。Apaf-1/cytochrome c 经需能的寡聚化形成大的蛋
白复合物
(Apoptosome)，后者聚集procaspase-9
5、 procaspase-9 经自身裂解而活化。
6、Caspase-9 裂解caspase-3 和其它caspases，激活凋亡的效应器期 effector phase
）,从而使细胞结构被破坏。
五、IAPs, 抑制caspase 活性的蛋白家族
A. IAPs are inhibitors of apoptosis protein. There are 7
identified IAPs in human.
B. IAPs inhibit apoptosis by inhibiting caspase activities.
C. IAPs provide a safeguard mechanism against minimal activation
of the apoptosis program.
D. Several IAPs are overexpressed in tumors.
第三节 凋亡与疾病
A. Cancer
B. Autoimmune disease
C. Neurodegenerative disease
1. ALS - Amyotrophoic lateral sclerosis or Lou Gehrig’s disease
2. Spinal muscular atrophy
第八章 基因克隆
基因克隆（gene
cloning）或分子克隆,又称为重组ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA
分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形
成大量的子代DNA 分子的过程。
克隆（clone）一指含有单一的DNA 重组体的无性繁殖系，或指将DNA 重组体引入宿主细
胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。
一个完整的基因克隆过程包括以下步骤：
１、 获得待克隆的DNA 片段（基因）；
２、 目的基因与载体在体外连接；
３、 重组DNA 分子导入宿主细胞；
４、 筛选、鉴定阳性重组子；
５、 重组子的扩增与／或表达。
第一节 重组DNA 中常用的工具酶
包括限制性核酸内切酶、DNA 连接酶、DNA 聚合酶、逆转录酶等，
一、限制性内切酶的定义、命名和分类
限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA 序列的一种内切核酸酶。
限制性核酸内切酶的来源：细菌的限制－修饰系统。
分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第Ⅱ类。
限制性核酸内切酶的命名。
二、限制性核酸内切酶的作用特点
1、识别位点的DNA 序列呈二重旋转对称（即具有迥文结构）；
2、切割DNA 均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端；
3、 错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA 产生平头末
端，也称钝性末端。
4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶，如MboI Ⅰ和 Sau3A。
三、其它工具酶
参考“分子克隆”（Sambrook,J et al . molecular cloning）
第二节 载体－宿主系统
一、概述
载体(vector)是携带外源DNA 进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质
粒、噬菌体或病毒等构建的。
载体应具备以下条件：
１、 能在适当的宿主细胞中复制；
２、 具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA 插入；
３、 具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；
４、 载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA 与宿主DNA 便于分离；
５、 对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达
元件。
宿主细胞是基因克隆中重组DNA 分子的繁殖场所，适当的宿主细胞，必须符以下条件：
１、 对载体的复制和扩增没有严格的限制；
２、 不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；
３、 在重组DNA 增殖过程中，不会对它进行修饰；
４、 重组缺陷型，不会产生体内重组；
５、 容易导入重组DNA 分子；
６、 符合重组DNA 操作的安全标准。
二、质粒载体
质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA 分子，能自主复制，并在
细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予
细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。
作为载体的质粒一般具有以下特点：
１、 分子相对较小（３∽１０kb）；
２、 松驰型复制；
３、 具有适当的多克隆位点以便外源DNA 插入；
４、 具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子；
５、 质粒能携带的外源DNA 片段一般较小（<15kb）．
三、λ噬菌体载体
λ噬菌体是一种双链DNA 噬菌体，基因组约为50kb+。
线性λ噬菌体DNA 分子的两端各有12 碱基的互补单链序列，是天然的粘性末端，称为COS
位点。
λ噬菌体的生活周期：溶菌（裂解）生长时在平皿上形成清亮的噬菌斑；溶源性生长。
λ噬菌体的基因组：左臂长约20kb,含噬菌体头、尾蛋白编码基因；中央片段长约12-24kb,
对噬菌体为非必需区；右臂长约10kb,含λ噬菌体复制和溶菌相关蛋白的编码基因。所有λ
噬菌体载体均为通过切除非必需的中央区，并增减某些限制性酶切位点和插入适当的筛选标
记基因改造而成。
已构建的λ噬菌体载体分为两类：
１、置换型载体：有两个酶切位点或两组排列相反的多克隆位点，其间的DNA 片段可被外
源DNA 置换。这类载体适于克隆5-20kb 的外源基因片段，常用于构建基因组DNA 文库。
２、插入型载体：只有一个限制性内切酶位点或一组多克隆位点可供外源基因插入。这类载
体允许插入5-7kb 的外源DNA,适于构建cDNA 文库。如λgt
噬菌体载体。
一般将噬菌体DNA 在体外包装成病毒颗粒后再用于感染受体菌，这样能大大提高转染效率。
四、Ｍ13 丝状噬菌体载体
Ｍ13 基因组大小为6407bp，它是一种闭环的单链DNA 分子，在感染细菌后呈双链复制型
DNA。因此用作克隆载体的双链DNA 可从细菌中分离得到。在细菌中，双链DNA 复制
100-200 拷贝后就大量产生单链DNA,后者包装成子代噬菌体颗粒，分泌到细胞外，而不裂
解细菌。
在M13 基因组中含507 个核苷酸的非必需区，在这个区域插入外源DNA 不会影响M13 的
繁殖和生存，现在使用的M13 载体如M13Mp18 等均为对此区域进行改造而获得。
M13 克隆的最大问题是不能插入较大的外源ＤＮＡ片段（一般<1000bp）,但M13 载体的优
点是从细菌中释放出来的噬菌体颗粒中含有一条与克隆的模板DNA 互补的单链，所以最适
合于制备DNA 测序时用的单链模板，另外也可用于制备单链特异性DNA 探针。
五、粘粒载体
粘粒（柯斯质粒）是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNA 的COS 区(约20-数百
bp)与质粒重组而成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复制，但不表达任何噬菌体的功
能。
粘粒的结构特点：
１、 含有抗药性标记和质粒复制起始位点；
２、 一个或多个单一限制酶切位点；
３、 带有λ噬菌体粘性末端；
４、 分子小（4-6kb）,可容纳大到40-50kb 的外源DNA 片段，因此适于构建真核生物基因
组DNA 文库。
六、酵母人工染色体载体
酵母人工染色体由酵母染色体的着丝粒(cen4)、自主复制序列(ARS1)和来自四膜虫的端粒
(Tel)等功能性DNA 序列组成。它可携带长达200-1000kb 的DNA 片段，因此在人基因组
DNA 大片段的克隆中非常有用，是染色体克隆排序的主要工具。
用酵母人工染色体克隆DNA 的过程与λ噬菌体相似，将DNA 大片段与载体的两臂相联，
然后将连接混合物转化进酵母细胞中，利用载体上的选择性标记进行筛选。
第三节 目的基因的获取
一、通过建立基因文库分离靶基因
基因文库包括两类：基因组文库和cDNA 文库，两种文库的建库过程不同，产生的基因结
构也不同，因此应用范围也不相同。
（一）、基因组文库
是含有某种生物体（或组织、细胞）全部基因的随机片段的重组DNA 克隆群体。
用λ噬菌体载体构建基因组文库的基本步骤：
１、 准备载体DNA(如置换型λ噬菌体载体)，用适当的限制酶消化并分离得到载体的左右
两臂；
２、 纯化真核细胞高分子量DNA，并用适当的限制酶部分消化；
３、 分离适当大小的基因组DNA 片段（20-24kb）；
４、 连接载体与外源ＤＮＡ；
５、 连接产物体外包装及感染；
６、 基因组文库的扩增。
由于基因组文库包含了染色体的所有随机片段形成的重组DNA 克隆，因此，利用适当的筛
选方法，就可以从中找出携带所需目的基因片段的重组克隆。
（二）、cDNA 文库
cDNA 是指以mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA.
以细胞的全部mRNA 逆转录合成的cDNA 组成的重组克隆群体称为cDNA 文库。
从cDNA 文库可以获得较完整的连续编码序列（不含内含子），便于表达成蛋白质。
构建cDNA 文库的主要步骤：
１、 mRNA 分离；
２、 cDNA 第一链合成；
３、 cDNA 第二链合成；
４、 载体与cDNA 的连接;
５、 噬菌体的包装及转染；
６、 cDNA 文库的扩增和保存。
二、化学合成法制备DNA 片段
主要用于一些小的DNA 片段的合成。
三、聚合酶链反应法扩增基因片段
对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚合酶链反应（ＰＣＲ），以基因组DNA
或cDNA 模板扩增得到目的基因片段。
第四节 DNA 分子的体外连接
DNA 片段的体外连接是重组DNA 技术的关键。DNA 连接是由DNA 连接酶催化完成的。
一、DNA 连接酶
DNA 连接酶催化两年双链DNA 片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的的DNA 连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA 连接酶，
该酶需要ATP 作为辅助因子。
T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：
１、 连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；
２、 连接双链DNA 分子间的平端；
３、 在双链平端的DNA 分子上添加合成的人工接头或适配子。
二、粘性末端连接
如果载体和插入片段具有相同的粘性末端，则很容易用DNA 连接酶连接成环状的重组DNA
分子，但是要注意当载体和插入的两个末端均为同源的粘性末端时，连接后可能出现以下问
题：
１、 载体自身环化，造成假阳性背景克隆，为避免此问题，可在连接前，用碱性磷酸酶将
载体DNA 5’-
端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接；
２、 插入片段可双向插入；
３、 插入片段可多拷贝插入。
当DNA 片段两端为非同源的粘性末端时，可实现定向克隆，这时的连接效率非常高，是重
组方案中最有效、简捷的途径。
三、平端连接
平端连接的优点是可用T4 连接酶连接任何DNA 平端，这对不同DNA 分子的连接十分有利。
因为除了相同或不同限制酶酶切产生的平末端分子外，含3’-或5’-突出的粘性末端也可
以被补齐或削平，实现平端连接。
（一）、5’-突出粘性末端的补齐
限制酶降解产生的5’-端突出的粘性末端，可用大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ的大片段（klenow
片段）补齐。
（二）、3’-突出粘性末端的削平
含3’- 突出的粘性末端可用T4 DNA 聚合酶的3’→5’外切核酸酶活性补平。
平端连接的主要问题是，它的连接效率比粘性末端低，因此需较多的T4
DNA 连接酶和较高的底物浓度，聚乙二醇（ＰＥＧ）可促进平端连接反应。
四、人工接头连接
对平端DNA 片段，可借助人工合成的接头来方便连接。所谓接头是人工合成的至少８个核
苷酸长的一段迥文序列。接头是平端，在磷酸化后通过T4
DNA 连接酶可与大多数平端DNA 连接。连接后用相应的限制性内切酶切割，可产生所需
要的粘性末端。
五、利用适配子连接
适配子是人工合成的具有一个以上限制酶识别位点的短序列，它具有一个平端，可与其它
DNA 的平端连接，同时它还有某种限制酶的突出端，可与含互补的限制酶突出端的DNA
片段连接，连接后，用适当的限制酶切割又可产生所需要的突出粘端。
第五节 重组DNA 导入宿主菌
体外连接的重组DNA 分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据
所采用的载体的性质，将重组DNA 分子导入受体可有不同的方法。
一、转化
指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理
使之处于感受态－即容易接受外源DNA 的状态，然后利用短暂热休克使DNA 导入细菌宿
主中。
此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。
二、转染和感染
利用噬菌体DNA 作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染，即在体外将噬菌体
DNA 包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。另一种方式是转染，即在DNA 连接酶作用
下使噬菌体DNA 环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA
为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。
第六节 重组克隆的筛选与鉴定
基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正
确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基
因的结构、功能，或表达该基因的产物。
一、抗药性标志的筛选
如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr 或tetrr
，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这
样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA 时将外源基因插入标志基因内，该标
志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）
的转化菌落。
二、β－半乳糖苷酶系统筛选
很多载体都携带一段细菌的lacZ 基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146 个氨基酸，称为
α－肽，载体转化的宿主细胞为lacZΔ15 基因型，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链，当
载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的底物
X-gal
变为兰色化合物，这就是所谓的α－互补，而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能
形成α－互补，在含X-gal 的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。
三、菌落快速裂解鉴定法
从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法
适于插入片段较大的重组子初筛。
四、内切酶图谱鉴定
经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA,用相应的
内切酶切割，释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插
入的方向。
五、通过聚合酶链反应筛选重组子
一些载体的外源DNA 插入位点两侧存在特定的序列，如启动子序列等，利用这些特异性序
列作为引物，对小量制备的质粒DNA 进行聚合酶链反应（PCR）分析，不但可迅速扩增插
入片断，判断是否阳性重组子，还可直接对插入进行DNA
序列分析。
六、菌落或噬菌斑原位杂交
它是先将转化菌落或噬菌斑直接铺在硝酸纤维素膜或琼脂平板上，再转移至另一膜上，然后
用标记的特异DNA 探针进行分子杂交，挑选阳性菌落。该法能进行大规模操作，一次可筛
选多达5x105-5x106 个菌落或噬菌斑，特别适于从基因文库中挑选目的基因。
第九章 基因诊断
基因诊断是通过检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。
基因诊断的主要技术：
1、核酸分子杂交
2、聚合酶链反应（PCR）
3、基因芯片技术
第一节 核酸分子杂交技术
核酸杂交（Nucleic acid
hybridization）是指具有一定同源性的两条单链核酸在一定条件下，按碱基互补的原则重新
配对形成双链的过程。
一、核酸杂交的基本原理
DNA 的变性和复性：
在一定的条件（如适当的温度、有机溶剂存在等）下，DNA 的双链可解开成为单链，这一
过程称为DNA 的变性（Denaturatioin）。高温、低盐和有机溶剂促进DNA 变性。
Tm 值是反映DNA 的热稳定性的一个参数，称为DNA 的熔化温度，系指一半的双链DNA
解离成为单链时的温度。
DNA 的热稳定性或Tm 值直接与其碱基组成特别是GC 碱基对含量有关，GC 碱基对含量越
高，Tm 值也越高。
DNA 的杂交即复性（Renaturation）是变性的单链DNA 在一定的条件下（低于Tm 的温度
下）与其互补序列退火形成双链的过程，因此杂交与Tm 值相关。
影响杂交的主要因素：
温度：一般在低于Tm 约15 至２５度的温度下杂交速率最快。
盐浓度：钠离子增加杂交分子的稳定性，降低钠离子浓度强烈地影响Tm 值和复性速率。但
当钠离子浓度超过0.4M 时，对复性速度和Tm 值影响不大。
甲酰胺：有机溶剂如甲酰胺能减少双链核酸的稳定性。每增加1%的甲酰胺，DNA/DNA 或
DNA/RNA 双链的Tm 值减少0.72℃。常用50%甲酰胺
硫酸葡聚糖：使杂交速率增加，但有时可能增加杂交本底。
二、 核酸探针的选择和标记
核酸探针是指能与待检测的靶核酸序列互补杂交的某种已知核酸片段，它必须具有高度的特
异性，并且带有某种适当的标记以便被检测。
（一）核酸探针的类型
1、克隆的DNA 片段，常用cDNA 探针。
2、RNA 探针（Riboprobe）
RNA 探针的优点是特异性高；杂交效率(灵敏度)更高。适合于Northen 杂交、原位杂交等。
主要缺点是不稳定，易被降解，另外其制备较困难。
3、寡核苷酸探针 可用化学方法人工合成，制备较方便，但灵敏度稍差。
4、聚合酶链反应扩增产物 是很好的探针来源，其优点是制备和标记相对容易。
（二）核酸标记的类型
放射性同位素
目前应用最广，优点是灵敏度高，特别适用于单拷贝基因或低丰度mRNA 检测，缺点是易
造成放射性污染以及半衰期短，使用不便。
核酸探针标记常用的同位素有以下几种：
１、 ３２P：其放射性强，自显影时间短，灵敏度较高，缺点是半衰期短（14.3 天），放射
线散射较严重，因此对分辩率有影响。
２、 35S
：放射性较低，半衰期长（87.1 天），灵敏度较高；低散射，因此在用Ｘ－光片自显影时分
辩率高，特别适用于核酸序列分析和原位杂交等实验。
３、 33P ：是一种较理想的同位素，它的放射性较低，灵敏度高，分辩率好，半衰期也较
长(25.4 天)，适用范围较广。但价格偏高。
非同位素标记：常用地高辛或生物素系统。
优点：无放射性污染，较稳定；缺点：灵敏度、特异性稍差。
（三） 核酸探针的标记
1、随机引物法（Random priming）
随机引物是人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的混合物，因此可以与任何
核酸片段杂交，并作为聚合酶反应的引物。
标记酶：大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ的大片段－klenow 片段。
特点：所得探针的放射性比活较高，适用于大多数杂交。
2、缺刻平移法(Nick translation0
标记酶：大肠杆菌DNaseⅠ（极微量）和DNA 聚合酶Ⅰ。
用缺刻平移法制备的探针较短，较适合于原位杂交。
3、RNA 探针的制备和标记
RNA 探针可用RNA 聚合酶体外转录法制备。该方法的合成效率高，所得产物大小均一，有
较高的比活，特异适合于Northern 杂交和原位杂交。
4、聚合酶链反应标记DNA 探针
利用Taq DNA 聚合酶和标记的dNTP,sk 以少量的起始模板合成高比活的c 双链或单链DNA
探针。
5、寡核苷酸探针的标记
5’-端标记：T4 多核苷酸激酶标记法，一般用于制备DNA 序列分析时用的5’-标记的寡苷
酸引物。
3’-端标记：末端转移酶法，32P-dNTP 或ddNTP。
6、非同位素核酸探针标记：地高辛或生物素标记的核酸探针的制备方法和同位素探针相似。
但是不能用多核苷酸激酶标记法直接对5’-端进行非同位素标记。
三、常用核酸杂交技术
滤膜杂交
固相杂交
核酸杂交 原位杂交
液相杂交
滤膜杂交是指先将待检测的核酸序列结合到适当的固相支持物如尼龙膜上，然后与存在于溶
液中的已标记探针进行杂交的过程。
滤膜杂交的基本过程为：
1、核酸探针的制备和标记；
2、核酸片段的凝胶电泳分离；
3、将凝胶中的核酸片段通过印迹（blot）转移到某种固相支持物上；
4、用标记的探针与被固定的靶核酸序列杂交（通过还包括预杂交）；
5、洗膜（除去未杂交的游离探针等）；
6、检测带标记的杂交分子（放射自显影或酶联反应）。
（一） 斑点／狭缝印迹（Dot/slot
blot）杂交：DNA 或RNA 样品经变性后直接点样于尼龙膜上，然后进行杂交和检测。其优
点是简单、迅速，可同时做多个样品；缺点是特异性不好，有一定比例的假阳性，此外，靶
核酸的分子大小难于判断。
（二） Southern 印迹：指将经过电泳分离的DNA 片断转移到一定的固相支持物的过程。
Southern 印迹杂交的步骤如下：
1、用限制性内切酶消化大分子DNA;
2、用琼脂糖凝胶电泳对DNAa 片段按分子量大小分离；
3、将DNA 片段在琼脂糖凝胶电泳中变性成单链后，再转移到适当的固相支持物上并与之
结合；
４、 探针与膜上的DNA 杂交；
５、 检测。
Southern 印迹杂交主要用于基因组结构分析、基因组DNA 的定性和定量分析以及利用限制
性片段长度多态性进行基因突变分析等。
（三）
Northern 印迹：是指RNA 经变性凝胶电泳后，将其转移到固相支持物上，以便用杂交反应
检测特定的mRNA 分子的含量与大小。是基因表达研究分析的标准方法。
Nothern 印迹的基本过程包括：
1、RNA 的提取；
2、RNA 变性电泳；
3、RNA 转移和固定；
4、杂交；
5、检测。
除RNA 的提取和变性胶电泳与DNA 不同外，其余基本与Southern 印迹相同，关键是减少
实验中的RNA 酶污染。
（四） 核酸杂交在基因诊断中的应用
通过核酸杂交技术，可以利用带有某种标记的已知核酸片段作为探针，去检测未知核酸序列。
因此，核酸杂交可用于基因鉴定和基因突变分析等领域。
1、限制性片段长度多态性（RFLP）分析
多态性（polymorphism）指基因组中特定基因座位（DNA 序列）存在两种或两种以上状态
（等位基因），并且其中任何一个等位基因在人群中的频率不低于1%。
限制性片段长度多态性（RFLP）是由于DNA 变异（产生新的酶切位点或消除原有的酶切
位点）导致在限制性核酸内切酶酶切时产生不同长度的片段。可借助southern
blotting 或PCR 的方法进行检测
RFLP 分析与遗传病基因诊断。
人类染色体VNTR 序列的RFLP 分析图谱：DNA fingerprinting。
2、等位基因特异性寡核苷酸（ASO）探针杂交
寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，因此可用人工合成的针对正常和突变
等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交，检测点突变。
3、基因表达分析
常用Northern blotting 或原位杂交分析。
第二节 聚合酶链反应（PCR）技术
一、PCR 的基本原理
（一）PCR 的基本过程
PCR 是一种体外扩增特异DNA 片段的技术。它包括下列三个基本步骤：
1、变性（Denaturation）：待扩增的DNA 模板加热变性成单链；
2、退火（Annealing）：降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物退火；
3、延伸（Extension）：在适当条件下，利用DNA 聚合酶使引物延伸，产生新的双链。上述
变性、退火、延伸步骤的重复循环，导致特异的靶序列的指数扩增。
PCR 产物是介于引物的5’端之间的双链DNA 片段。
（二）PCR 体系中的主要成份
1、Taq DNA 聚合酶
是一种耐热的DNA 聚合酶，具有5’-3’DNA 聚合酶活性，一般有5’-3 外切酶活性，有
或无3’-5’外切酶活性（校对活性），无校对活性的酶在PCR 中错掺率较高。
PCR 中 Taq 酶的用量一般为0.5-2.5U，过多易造成非特异性扩增，过少可能灵敏度不够。
2、寡核苷酸引物 是决定PCR 扩增特异性的关键。
设计PCR 引物时的几条原则：
① 引物长度一般15-30 碱基，过短则特异性低；
② 避免内部二级结构；
③ G/C 和A/T 碱基均匀分布，G/C 含量在45%-55% 之间；
④ 两个引物（特别是3’端）间不能发生互补，以免形成引物引物二聚体；
⑤ 引物的3’-端碱基一般应与模板严格配对，并且3’端为G、C 或T 时引发效率较高；
⑥ 引物的5’-端可添加与模板无关的序列（如限制性内切酶的识别位点、ATG 起始密码子
或启动子序列等）
PCR 中所用引物浓度一般在0.1-0.5uM 太高的引物浓度易造成非特异性扩增，太低会降低合
成效率。
3、MgCl2 Mg2+浓度除影响Taq 酶活性外，还影响双链DNA 的Tm 值，因而影响PCR 的
特异性和扩增效率。
PCR 中的最适MgCl2 浓度一般为1.5-2.5mM(注意游离Mg2+浓度还与能结合Mg2+的化合物
如dNTP、EDTA
等的浓度有关。
4、脱氧核苷三磷酸（dNTP）一般采用均衡的dNTP 浓度，4 种dNTP 各为
200umol/L,dNTP 可减少游离Mg2+，因此影响聚合酶活性和引物退火。
5、模板 单、双链DNA，以及RNA 经逆转录合成的cDNA。
PCR 样品可以是粗制品，但不应含有核酸酶和蛋白酶及其它干扰Taq 酶活性的抑制剂 。
引物/模板的比率影响PCR 的特异性。
(三)PCR 循环参数
1、预变性（Initial denaturation）．
模板DNA 完全变性对PCR 能否成功至关重要，一般95℃加热3-5 分钟。
2、引物退火（Primer annealing）
退火温度一般需要凭实验（经验）决定。
退火温度对PCR 的特异性有较大影响。
3、引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq 酶最适温度）。
延伸时间随扩增片段长短而定。
4、循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30 秒足以使各种靶DNA 序列完全变性：
变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
5、循环数
大多数PCR 含25-35 循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15 分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双
链。
（四）PCR 中的污染和假阳性
PCR 中污染主要来自
1、样品间交叉污染；
2、先前PCR 产物遗留（carry-over）
二、几种常用特殊PCR 技术
（一）逆转录PCR（Reverse transcription－PCR,RT-PCR）
RNA 经逆转录后可作为PCR 的模板.逆转录PCR（RT－PCR）常用于基因表达研究（定量
PCR）和逆病毒检测．
设计RT－PCR 引物时，应使引物分别位于不同的外显子中，以便区别cDNA 和gDNA 扩增
产物。
（二）多重PCR（Multiple PCR）
在同一PCR 反应体系中用多对引物（覆盖不同长度的靶序列）同时扩增。
例如用多重PCR 进行DNA 缺失筛选
(三) 套式PCR（nested PCR）
用第一次PCR 扩增区域内部的第二对（套式）引物对第一次PCR 产物再次扩增,可以增加特
异性和灵敏度。
(四)非对称PCR（asymmetric PCR）
在PCR 反应体系中，限制引物之一的浓度（50－100:1）进行扩增，可得到单链PCR 产物,
可用于制备单链测序模板或单链DNA 杂交探针。
三、PCR 与突变检测
通过PCR 扩增片段的多态性分析有助于检测各种突变。
PCR 扩增产物的多态性可分为三种类型：
1、限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism-RFLP）;
2、序列多态性(Sequence polymorphism);
3、长度多态性(Length polymorphism)
（一）PCR-RFLP 分析
设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一或数个多态性的限制性内切酶识别序列，在PCR
扩增后用该限制酶切割PCR 产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断，该方法
主要用于检测各种已知突变。
（二）PCR 结合ASO 探针杂交分析
ASO（Allele specific
oligonucleotide）探针：等位基因特异性寡核苷酸探针，指针对各种正常和突变靶序列设计
的特异性寡核苷酸探针。
1、PCR 产物变性后斑点印迹至膜上，用一系列AS0 探针杂交，严格控制杂交和洗膜条件、
确保正常ASO 探针只与正常靶序列条交，而突变ASO 只与含相应突变碱基的靶序列杂交。
2、另一种方法是将ASO 探针固定在膜上，然后与生物素标记的PCR 产物杂交-反向斑点杂
交（reverse
dot－blot），这样一次杂交可完成多个探针检测。
上述方法适用于基因组中某些固定位点上的已知序列差异的检测，如癌细胞中的ras 突变，
HLA typing 等。
（三）等位基因特异性扩增（A11eles specific
amplification，ASA）-又称扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation
system，ARMS)
利用PCR 引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA 互补才能有效扩增的原理，设计等位基
因特异性
PCR 扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR 扩增带，
从而检测出突变，该法省去了探针杂交操作。
（四）PCR-SSCP 分析
单链DNA 在中性条件下，由于碱基配对等分子内相互作用而具有复杂的折叠构象，在聚丙
烯酰胺凝胶电泳中，其迁移率除与长度有关外，还与其构象有关。DNA 的突变造成DNA
片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同—单链构象多态性
（Single
strand conformation polymorphism，SSCP），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链得以
分离。
PCR 一SSCP 的步骤：PCR 扩增→产物热变性成单链→非变性PAGE→显示（放射自显影或
银染等）
PCR－SSCP 是检测点突变的简便灵敏方法，已用于多种遗传病、肿瘤中原癌基因和抑癌基
因的突变分析，对＜200bp 片段其灵敏度较好，靶序列增长时其灵敏度下降（一般175-345nt）。
（五）扩增片段长度多态性（Amp-FLP）
VNTR、STR 等重复序列，因重复单位数目的不同而呈现高度多态。因此利用重复序列两侧
的特异性引物进行PCR 扩增，所得扩增片段具有高度多态性，这些不同长度的等位片段可
用PAGE 分离。
（六）PCR 直接测序
DNA 序列分析是检测基因突变最直接最可信的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定
突变的性质。PCR 直接测序是指对PCR 产物直接进行序列分析，而不是先将DNA 待测片
段克隆于测序载体上，这可大大的简化操作步骤。
PCR 产物测序常采用循环测序法（cycle
sequencing）：在PCR 反应体系中同时将ddNTP 加入，并利用同位素或荧光素标记的引物引
导扩增，使模板的扩增与测序同时进行。应用PCR 测序有以下优点：模板需要量小；方法
简便，易自动化；测序效率高。
四、PCR 在基因诊断中的应用
（一）遗传病的基因诊断
目前已有近百种遗传病可用PCR 技术进行诊断和产前诊断。用PCR 对遗传病进行诊断的前
提是对致病基因的结构必须部分或全部清楚。
.如利用PCR-RFLP 或Amp-FLP 对遗传病家系进行连锁分析，进而作出基因诊断。
（二）传染病诊断
PCR 已应用于多种病原体的特异性检测和鉴定
1、病毒：如HBV，HCV，HIV，HPV 等。
2、致病菌：如淋球菌、结核杆菌、军团菌、幽门螺杆菌、肺炎支原体等；
（三）肿瘤基因诊断
1、原癌基因和抑癌基因突变，如ras,p53；癌基因扩增和表达分析。
2、利用微卫星不稳定性，直接诊断肿瘤，如膀胱癌等；
3、分析白血病（如CML）中异常染色体易位，检测微小残留病变（Minimal residual disease，
MDR）
4、肿瘤多药耐药性（multi-drug resistance,MDR）检测
5、端粒酶活性检测
第三节 基因芯片技术
基因芯片（Gene chip/DNA chip）又称为DNA 微矩阵（DNA
Microarray），是包被在固相载体上的高密度DNA 的微阵列。
一、基因芯片的类型：
1、 寡核苷酸芯片：采用固相原位合成技术制备的，或用传统方法合成后再固定于芯片上的
寡核苷酸探针阵列（Genechip,
Affymatrix,Inc）。
2、 DNA 微矩阵（DNA
Microarray）：将DNA 探针通过自动化点样技术固定于特定的固相支持物如玻璃表面，然后
再与靶序列杂交。
二、基因芯片技术的原理
DNA 芯片技术是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定于支持物（如膜、
硅片或玻璃片）上，然后通过类似核酸杂交的的方法与待测的标记样品按碱基配对原则进行
杂交，再通过检测系统对其进行扫描，并用相应软件对信号进行比较和检测，得到所需的生
物信息。其特点是可进行基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究。
用DNA 微矩阵进行基因表达分析的步骤
1、分离（待比较的）不同组织或细胞的mRNA,逆转录法制备带不同荧光标记的cDNA 探针；
2、混合探针，并与microarray 杂交，洗涤除去未结合探针。
3、 用特有波长的激光扫描芯片，并用共聚焦显微镜检测各探针的荧光，各element 的相对
荧光强度反映特异mRNA 的相对丰度。
三、基因芯片技术的应用
1、 疾病诊断（遗传病、肿瘤和病原体诊断）
2、 新药筛选和毒理学研究
3、 突变/多态性检测
单核苷酸的多态性( single nucleotide polymorphism, SNP)。
4、 基因表达分析
5、 发现新基因
四、表达谱基因芯片的特点及其应用
利用基因芯片可进行高通量基因表达平行分析，是基因功能研究的重要手段。对来源于不同
个体（正常人与患者）、不同组织、不同细胞周期、不同发育和分化阶段、不同病变、不同
刺激（包括不同诱导、不同治疗阶段）下的细胞内的mRNA 或逆转录后产生的cDNA 与表
达谱基因芯片进行杂交，可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、
分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因
与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时进一步研究基因与基因间相互作用
的关系。
采用表达谱基因芯片研究基因表达与传统的Northern Blot 相比有许多重要的优点：
1、检测系统的微型化，对样品等需要量非常小
2、同时研究上万个基因的表达变化，研究效率明显提高
3、能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，从而研究基因与基因之间内在的作用关系
4、检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表达情况
5、节约费用和时间
Further Readings
1. Ekins R. and Chu F.W. Microarrays: their origins and
applications. Trends in Biotechnolology, 1999, 17, 217-218.
2. Sinclair, B. Everything&#39;s Great When It Sits on a Chip - A
bright future for DNA arrays, The Scientist, 1999 May 24, 13(11),18-20.
3. Nature Genetics published a special issue (January 1999
Supplement), The Chipping Forecast. It&#39;s a collection of more
than 10 reviews (60 pages) on different aspects of microarray
analysis. All the reviews are freely available online.
4. Schena, M., Heller, R.A., Theriault, T.P., Konrad, K.,
Lachenmeier, E., and Davis, R.W. Microarrays: biotechnology&#39;s
discovery platform for functional genomics. Trends in
Biotechnology 1998, 16, 301-306.
5. Service, R.F. Microchip arrays put DNA on the spot. Science
1998, 282(5388), 396-399.
6. Ramsay, G. DNA chips - states-of-the-art. Nature Biotechnology
1998, 16(1), 40-44.
7. Marshall, A.; Hodgson, J. DNA chips - an array of
possibilities. Nature Biotechnology 1998, 16(1), 27-31.

不是很完全吧
似乎只是简要版

如果写得和书本一样繁,就不叫笔记了.

太多了.

好人  帮你顶起来

好东西。。。
顶了。。